PEWARNAAN GRAM

Prinsip :
Merupakan pewarnaan diferensial yang membedakan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri mempertahankan warna para rosanilin, seperti kristal violet, metil violet atau gentian violet setelah proses dekolorisasi dengan aseton, alkohol atau aseton iodium.

Komposisi :
1. Kristal violet bermanfaat sebagai pewarnaan primer. Zat warna primer ini diikuti dengan pemberian larutan iodine, yang disebut mordant, biasanya suatu senyawa metalik yang bergabung dengan zat warna untuk membentuk senyawa berwarna yang tidak larut. Presipitat yang tidak larut ini disebut: kompleks kristal violet iodine.
2. Decolorizer biasanya etanol 95% atau alkohol aseton.
3. Safranin berfungsi sebagai zat warna pulas tanding.


Mekanisme :
Beberapa spesies bakteri mempunyai sifat kimia alami pada dinding selnya yang dapat menahan kristal violet setelah diberikan decolorizer. Di bawah mikroskop bakteri yang dapat menahan warna ini tampak biru gelap, disebut Gram +. Sedangkan pada beberapa bakteri, kristal violet menghilang setelah pemberian decolorizer. Bakteri tersebut kemudian menahan pulasan tanding Safranin sehingga tampak merah, dan disebut Gram -.

Teori Penyebab Gram + dan Gram - :
1. Gram Negatif ( - )
Dinding sel Gram – mempunyai kandungan lipid yang lebih besar. Lipid larut dalam alkohol dan aseton ( decolorizer ). Hilangnya dianggap meningkatkan ukuran pori dinding sel dan menyebabkan terjadinya dekolorisasi yang lebih cepat.
2. Gram Positif ( + )
Kompleks kristal violet – iodine - ribonukleat membentuk Gram +. Ikatan ini tidak dapat dipecah oleh decolorizer.


Faktor- faktor yang menyebabkan variasi reaksi Gram :
1. Pewarnaan berlebihan sehingga dinding sel luntur. Sel Gram + melepas zat warna primer dan menerima pulas tanding.
2. Densitas sel pada hapusan. Hapusan yang terlalu tipis tidak menimbulkan dekolorisasi yang seharusnya.
3. Konsentrasi dan kesebaran reagen Gram.
4. Lama dan proses pencucian setelah pemberian kristal violet, jumlah air yang tersisa pada hapusan waktu diberi iodine.
5. Sifat, konsentrasi, jumlah decolorizer.
6. Usia kultur bakteri. Reaksi Gram hanya untuk usia kultur sampai 24 jam. Pewarnaan Gram mungkin atipik pada kultur yang masih sangat baru, terlalu lama, mati atau degenerasi.

Quality control
Staphylococcus aureus berwarna biru atau ungu, untuk Gram +
Escherichia coli berwarna merah, untuk Gram - .

Kepustakaan:
1. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, et al. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. 5th ed. Lippincott. Philadelphia.1997 : p86-8.
2. Beishir L. Gram staining.In : Microbiology in practise. A self instructional laboratory course.5th ed. Harper Collins. New York.1991 : p 223 - 30.